IDENTIFIKASI
MIKROBA
Oleh
Bayu Apriliwan
05031281320017
TEKNOLOGI HASIL
PERTANIAN
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS SRIWIJAYA
INDRALAYA
I.
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Identifikasi
mikroba merupakan salah satu tugas yang lazim dilakukan di laboratorium
mikrobiologi.Bakteri memiliki beberapa macam bentuk yaitu basil (tongkat),
coccus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi
menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal,
diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus,
diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu
setengah melengkung dan melengkung.
Melihat
dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri
itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Mikroorganisme yang
ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu
pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras
dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara
untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah
dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk
mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri
melalui serangkaian pengecatan.
Uji
biokimiawi bakteri adalah salah satu uji yang dilakukan untuk mengidentifikasi
jenis bakteri. Hal ini karena setiap jenis bakteri memiliki sifat biokimia yang
berbeda. Secara morfologis, biakan maupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak
serupa. Karena itu ciri fisiologis atau biokimiawi merupakan kriteria yang amat
penting di dalam identifikasi spesimen yang tidak dikenal. Tanpa hasil
pengamatan fisiologis yang memadai mengenai organisme yang diperiksa maka
penentuan spesiesnya tidaklah mungkin dilakukan. Manusia tidak dapat melihat
dan mengidentifikasi bakteri tanpa diadakan percobaan.
B. Tujuan Percobaan
Memahami
cara melakukan pewarnaan garam.
II. TINJAUAN PUSTAKA
Metode pengecatan pertama kali
ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode ini. Bakteri dapat
dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative.
Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi
atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga
pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai
dinding sel sepertiMycoplasma sp .Berhasil
tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur
biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam : Biakan muda). Bila
digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil pewarnaan gram.
Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-dinding selnya.
Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu
dicuci dengan larutan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan
dinding sel yang rusak tidak lagi dapat mempertahankan crystal violet sehingga
terlihat sebagai bakteri gram negatif. Umumnya zat warna yang digunakan adalah
garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif
dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua,
yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna
adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion
yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut
pewarna negatif (Hadiutomo. 1990).
Zat warna yang digunakan dalam
pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna basa bagian yang berperan
dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan memiliki muatan positif.
Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna
mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan
negatif banyak ditemukan di dinding sel, membran sel dan sitoplasma, sewaktu
proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan
muatan negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat
(Dwidjoseputro.1998).Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak
digunakan untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk
mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan positif, perlu diperhatikan bahwa
muatan dan daya ikat zat warna terhadap struktur sel dapat berubah bergantung
pada pH sekitarnya sewaktu proses pewarnaan (Dwidjoseputro.1998).
. Zat warna asam
yang bermuatan negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif yang
terdapat pada struktur sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk
mewarnai bagian sel yang bermuatan Terdapat berbagai cara mengisolasi
mikroba, yaitu: Isolasi Pada Cawan Agar :Prinsip metode isolasi pada agar cawan
adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang
dapat dipisahkan dari mikroorganisme lain. Setiap koloni yang terpisah yang
tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel
tunggal. Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada cawan agar, yaitu:
metode gores kuadran dan metode agar cawan tuang. Metode gores
kuadran bila metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan
terisolasinya mikroorganisme dimana setiap koloni berasal dari satu sel. (Dwidjoseputro.1998)
Prosedur
pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut pewarnaan positif
dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat warna basa yang yang bermuatan
positif maupun zat warna asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya pada pewarnaan
negatif latar belakang disekeliling mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan
kontras dengan mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan mencakup penyiapan
mikroorganisme dengan melakukan preparat ulas Sebelum dilakukan pewarnaan
dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan ini kemudian difiksasi. Jumlah
bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak sehingga dapat terlihat
.Kesalahan yang sering kali
dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat terutama bila
suspensi tersebut berasal dari bukan media padat. Sebaliknya pada suatu
suspensi bakteri bila terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan sewaktu
mencari bakteri pada preparatnya .Metode
agar tuang berbeda dengan metode gores kuadran, cawan tuang menggunakan
medium agar yang dicairkan dan didinginkan 50oC, yang kemudian dicawankan.
Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir mengandung
koloni-koloni yang terpisah di atas permukaan/di dalam cawan. -Isolasi
Pada Medium Cair : Metode ini dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat
tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur
cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial
pengenceran. Semakin tinggi pengenceran, peluang untuk mendapatkan satu sel
semakin besar.-Isolasi Sel Tunggal :Metode ini dilakukan untuk mengisolasi sel
mikroorganisme berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode
cawan atau medium cair. Sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan
perbesaran sekitar 100 kali. (Waluyo, 2004).
III. METODOLODI
PRAKTIKUM
A. Waktu Dan
Tempat
Praktikum
identifikasi mikrobia ini dilaksanakan pada hari Senin tanggal 13 dan 20
Oktober 2014 pukul 10.00 WIB sampai dengan pukul 12.00 WIB di
Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan
Teknologi Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas Sriwijaya.
B. Bahan Dan Alat
a. Identifikasi
Bakteri
1. Pewarnaan
Gram
Bahan yang
digunakan dalam praktikum kali ini adalah Biakan hasil isolasi (Bakteri E.coli
dan Bakteri Eureus).
Alat yang
digunakan adalah 1). Bak Pewarna 2 ). Jarum Ose 3). Kaca Objek 4). Kertas Serap
5). Mikroskop Majemuk 6). Minyak Celup
2. Uji Katalase
Bahan yang
digunakan dalam praktikum kali ini adalah Biakan hasil isolasi dan hidrodgen
peroksida (H2O2).
Alat yang
digunakan adalah 1). Jarum Ose dan 2). Kaca Objek bersih
b. Identifikasi
Jamur
Bahan yang
digunakan adalah 1) Alumunium Foil, 2) Alkohol, 3) Ampicilyn, 4) Aquadest
Steril, 5) Lactophenol
Blue, 6) Media
PDA steril, 7) Kapas , 8)Karet
Gelang, 9) Kertas
Tissue Steril, 10)
Spiritus, 11)Wrapping.
Alat yang
digunakan adalah 1). Cawan Petri Steril 2). Cover Glass Steril 3). Jarum Ose
4). Kaca Objek 5). Spatula.
C. Cara Kerja
a.
Identifikasi Bakteri
1. Pewarnaan
Gram
Cara kerja
pada praktikum ini adalah sebagai berikut :
1) Kaca objek
yang bersih disiapkan.
2) Disiapkan 2
olesan bakteri pada kaca objek dengan jarak antara kedua olesan tersebut paling
sedikit 2 cm.
3) Kaca objek
tersebut difiksasi diatas bunsen selama beberapa menit.
4) Setelah
difiksasi, kaca objek diletakkan diatas rak kawat bak pewarna.
5) Olesan
bakteri digenangi dengan pewarna primer yaitu ungu krystal selama 1 menit.
6) Menggunakan
pinset, kaca objek dimiringkan diatas rak pewarna untuk membuang kelebihan ungu
krystal lalu dibilas dengan aquadest.
7) Kaca objek
ditiriskan dan kembalikan ke atas rak kawat pada bak pewarna.
8) Olesan
kemudian digenangi dengan larutan iodium selama 2 menit dan kemudian lakukan
seperti langkah 6.
9) Olesan
dicuci dengan larutan pemucat tetes demi tetes selama 30 detik atau sampai zat
warna ungu kristal tidak terlihat mengalir lagi.
10) Cuci kembali
dengan aquadest dan ditiriskan.
11) Lalu genangi
dengan safranin sebagai pewarna tandingan selama 30 detik.
12) Lakukan
kembali langkah 6 dan langkah 7.
13) Olesan
bakteri diamati warnanya, apakah berwarna biru gelap atau ungu (gram positif)
atau bewarna merah muda (gram megatif).
2. Uji Katalase
Cara kerja
pada praktikum ini adalah sebagai berikut :
1) Kaca Objek
yang bersih disiapkan.
2) Dua tetes
hidrogen peroksida diletakkan diatas kaca objek, kemudian secara aseptik biakan
murni bakteri dipindahkan keatas tetesan hidrogen peroksida dengan jarum ose.
3) Uji positif
ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung oksigen yang menunjukkan bahwa
mikrobia tersebut menghasilkan enzim katalase yang mengubah hidrogen peroksida
menjadi air dan O2.
b. Identifikasi
Jamur
Cara kerja
pada praktikum ini adalah sebagai berikut :
1) Media PDA
steril sebanyak 5 ml disiapkan secara aseptis kedalam cawan petri dan dibiarkan
hingga membeku.
2) Media PDA
steril yang telah beku dipotong persegi dengan ukuran ± 1cm x 1cm, diletakkan
diatas kaca objek yang telah disterilkan terlebih dahulu.
3) Diambil satu
mata ose jamur yang akan dibiakkan kemudian digoreskan pada keempat sudut PDA
steril diatas kaca objek, kemudian ditutup dengan kaca penutup yang telah
disterilkan.
4) Cawan petri
steril disiapkan pada bagian dalamnya dialasi dengan kertas tissue steril
kemudian ditetesi dengan 5 ml aquadest steril.
5) Kaca objek
yang telah berisi biakan jamur dimasukkan kedalam cawan petri kemudian ditutup
dan diberi wrapping pada sekeliling pinggir bagian penutup untuk mencegah
kontaminan.
6) Inkubasi
pada suhu kamar selama 48 jam.
7) Setelah 48
jam, kaca objek yang berisi biakan dikeluarkan dari cawan petri, medianya
dibuang. Kaca objek ditetesi dengan satu tetes lactophenol blue, tutup dengan
kaca penutup biarkan selama 1 jam supaya larutan lactophenol blue meresap kedalam hipa jamur.
8) Diamati
struktur jamur dengan menggunakan mikroskop yang meliputi bentuk hipa, spora
dan konidia jamur.
B. Pembahasan
Prinsip
dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi
ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada
pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan
pewarna basa. Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian
dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku Setiap sel terdiri dari berbagai bahan
kimia. Setiap sel akan menunjukkan susunan kimiawi yang spesifik. Sebagai
contoh, bakteri Gram negatif memiliki lipopolisakarida dalam dinding selnya,
Sedangkan bakteri Gram positif tidak. Sebaliknya pada banyak bakteri Gram
positif terdapat asam teikoat
Teknik
pewarnaan kuman yang kami lakukan pada praktikum ini adalah teknik pewarnaan
sederhana dan teknik pewarnaan gramteknik ini bertujuan untuk mengidentifikasi
suatu bakteri apakah dia termasuk ke dalam bakteri gram negatif atau bakteri
gram positif. Langkah-langkah dalam pewarnaan ini hampir sama dengan langkah
pada pewarnaan sederhana yakni membuat preparat oles dari ketiga bakteri
diatas. Bedanya adalah pada beberapa reagen yang ditambahkan. Pertama, bakteri
pada preparat ditetesi kristal violet selama 1 menit. Lalu kelebihan kristal
violetdibuang dengan memiringkan kaca objek dan bilas dengan air mengalir secara
perlahan. Preparat ditiriskan, lalu diberi larutan iodium gram selama 2 menit,
kelebihan iodium dibuang dengan memiringkan kaca objek lalu dibilas dengan air
seperti kristal violet. Langkah selanjutnya adalah preparat dicuci dengan
etanol 95% setetes demi setetes selama 30 detik atau sampai zat ungu kristal
tidak tampak lagi mengalir dari preparat, setelah dirasa warna menghilang cuci
perlahan lalu tiriskan. Terakhir adalah dengan menambahkan pewarna safranin
selama 30 detik pada preparat, kemudian kelebihan safranin dibuang dan dibilas
dengan air. Preparat yang masih basah ditiriskan dan diserap dengan menekankan
kertas serap disekitarnya.Amati preparat olesan bakteri yang sudah diwarnai
tersebut di bawah mikroskop.
V. KESIMPULAN
Dari percobaan ini, dapat diambil beberapa kesimpulan sebagai berikut:
1.
Untuk bakteri yang termasuk gram positif akan
terlihat berwarna ungu, dimana warna ungu ini sendiri merupaka warna dari
kristal violet yang sebelumnya diteteskan, warna ini melekat dengan kuat karena
peptidoglikan dari bakteri gram positif tebalMetode sterilisasi
antara lain secara fisik, kimia, dan mekanik.
2.
untuk bakteri
gram negatif akan terlihat warna merah, dimana warna merah ini merupakan warna
dari pewarna safranin yang diteteskan terakhir kali, warna ini melekat dan
warna ungu sama sekali tidak terlihat karena peptidoglikan dari bakteri gram
negatif relatif tipis sehingga ia tidak mampu mempertahankan warna ungu
layaknya bakteri gram positif.
3.
Morfologi yang
ditunjukkan koloni kuman dapat diidentifikasi dengan metode piringan goresan,
metode piringan tuangan, metode tusukan agar tegak, metode agar miring goresan,
metode medium cair.
4.
Zat warna adalah
senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna.
5.
Garam terdiri
dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini
berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri
akan memberikan warna berbeda.
DAFTAR PUSTAKA
Dwidjoseputro,
D.2005. Dasar – Dasar Mikrobiologi. Djambatan : Jakarta.
Hadioetomo. Ratna Siri.
1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: P.T. Gramedia
Pustaka Utama.
Hadioetomo,
Ratna Siri.1990.Mikrobiologi dalam Praktek. Jakarta: Gramedia.
Lay, Bibiana.1994.Analisis Mikroba di Laboratorium.Jakarta :
Rajawali
Sutedjo, Mul
Mulyani.1991. Mikrobiologi Tanah.Jakarta : Rineka Cipta
Volk, W. A. dan Wheeler, M. F. 1993. Mikrobiologi
Dasar Edisi Kelima. Jakarta: Erlangga.
Waluyo,Lud.2004.Mikrobiologi
Umum. Malang: UMM Press.
LAPORAN SEMENTARA
PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UMUM
Nama : Bayu apriliawan Tanggal : 13 oktober 2014
NIM :
05031281320017 Asisten :
 |
A.
Tujuan
Memahami
cara melakukan pewarnaan garam.
B. Hasil
0 komentar:
Post a Comment